《三人行必有我妹》讲述世界级企业帝野集团社长帝野熊五郎去世后，其独子帝野将悟遵循遗嘱，为继承社长之位接受为期一年的特别训练。训练要求他获得全体社员认可，并转入父亲母校私立深流院学园，寻找终身伴侣并结婚。将悟满怀期待地开始校园生活，却意外得知自己可能有一个同父异母的妹妹。更令他震惊的是，这位妹妹就隐藏在他身边，甚至可能是他心仪的女孩之一。为了不违背伦理，他必须在众多候选对象中找出真正的妹妹，同时寻找合适的结婚对象。作品以轻松幽默的方式展开，将悟与多位性格各异的女孩互动，包括青梅竹马、大小姐、偶像等，在误会与巧合中推进剧情。动画融合恋爱喜剧与悬疑元素，探讨亲情与爱情的边界，展现将悟在继承家业与个人情感间的挣扎。最终，他能否揭开妹妹之谜，找到真爱并顺利继承社长之位？